利用
沉香树（Lagerstroemia）作为实验材料，开发了一种新的外源蛋白瞬时表达方法，种子萌发的真空感染方法。色荧光蛋白的最佳工作条件作为报告基因表明，最佳工作条件如下：细菌的浓度的所述工作流体为OD 600 = 1.0〜1.5时，压力真空度为0.08MPa，真空侵染时间为1分钟。方法是简单地实现，并且可以一起感染大量植物材料沉香树和减少到15天试验期外源蛋白可以在植物，其表达的感染后12〜14天被收获相当于纸张注入方法。种大规模生产沉香树属植物外源蛋白的新方法。键词：沉香树;瞬时表达;发芽的种子;感染真空分类号：Q819文献代码：A文章编号：1007-7847豌豆（早期褐变病毒豌豆，EBV）的（2014）03-0218-04病毒早期褐变是病毒RNA双在植物沉香树，RNA链负责编码病毒包膜和线虫的传输相关的蛋白质，而由RAN链编码另一种蛋白质是参与运动和寄生链复制病毒。工修饰的沉香树早棕病毒载体是研究豆科植物基因功能和外源蛋白在豆科植物中瞬时表达的有效工具[1]。植物中的外源重组蛋白的瞬时表达是一个重要的研究的生物反应器：外源蛋白质的表达是高的，实验周期短，一个相对简单的操作的优点，但总体方法接种是实验系统功效的关键因素[2~5]。统的接种方法包括摩擦接种，叶片注射和体外真菌侵染植物组织[4-12]。作伤口，然后涂抹或喷洒在植物的叶子上进行接种。方法相对较重，实验成本较高[4]。
前，常用的植物组织真空感染方法主要采用真空压力接种分离的植物组织，如叶片等。方法使用简单，但在收获外来蛋白质之前难以离体保持组织的新鲜度。
[5]通过注射叶子接种的方法在活植物的叶子上进行;植物应该有2到3个未折叠的叶子，这种方法是常用的。
色荧光蛋白和其它重组蛋白已经在注射沉香树叶[6，7]的方法成功地表达，但实验操作已经表明，接种的这种方法是难以实现的分批生产外源重组蛋白。此基础上，本研究开发用于沉香树，由种子萌发即侵染真空方法外源蛋白质的高效表达的新方法，并优化了新的实验系统中，这表明发芽的种子用真空感染。外源蛋白的表达等同于喷射片的，但发芽种子的真空侵染的方法缩短了实验期间和可感染实验材料批次，一个新的工业制造方法外来蛋白质。料和方法实验材料质粒，菌株，抗体和植物材料根癌农杆菌GV3101已经我们早期棕色病毒沉香树pCAPE2-GFP和pCAPEI的laboratoire.Les表达载体被保存下来承蒙以下的科学丹麦科学院提供农业）。色荧光蛋白抗体和Rubisco大亚基抗体由东北师范大学遗传学研究所制备和提供。实验中使用的抗生素都是试剂利福平，卡那霉素，四环素和乙酰丁香酮从北京鼎国生物技术有限公司，DNA2000标记，低分子量标记物自Takara在购买的购买日本和蛋白质杂交的二抗。HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中山生物科技有限公司。于识别初棕色病毒沉香树pCAPE2-GFP的载体引物为：“-TGCCTTTGCTACGAACCT-3”上述引物由上海生物工程有限公司合成在实验中使用的菌体悬浮液中的成分为：如下：100毫摩尔/ L乙酰丁香酮，10毫摩尔/ L的NaCl，1.75毫摩尔/升的CaCl，250升吐温20的无菌水性溶液pH 5.6。白质提取缓冲液的各组分（1L）：KCl 0.2g，NaCl 8g，KH 2 PO 40.27g，Na 2 HPO 4 1.42g，pH 7.4。法早期棕色沉香树病毒载体的鉴定作为一个模板早褐病毒沉香树pCAPE2-GFP和pCAPEl的矢量标识。PCR条件是在94℃下预变性3分钟; 94°C 50°C，50°C 50°C，33°C。环：72°C，8分钟。应后，进行琼脂糖凝胶电泳。理厂的工作流体和材料应变早期棕色病毒的载体沉香树转移到农杆菌GV3101含卡那霉素（50毫克/升），利福平（50毫克/升）和四环素（25毫克/升）。期培养LB液体培养基。OD600值为0.8和1.0之间，将细菌收集细胞和细菌体重悬浮液调节以调节细菌工作流体的浓度，和含有两个载波农杆菌与比例混合浓度为1：1。室温下静置90分钟。
薇种子浸泡在淡水4至5小时，然后在28℃下在28℃下沉香树pube一个种子的温度置于培养箱发芽培养物然后将按钮长度1至2厘米放入上述工作溶液中。立和系统感染的优化由空种子萌发沉香树本研究选择了三个因素，包括真空处理的持续时间，细菌工作溶液的浓度和以真空压力优化系统，由绿色荧光蛋白（GFP）表示。（表达绿色荧光蛋白和植物的总数量的植物的数目之间的比率）来评价système.Lexpérience的有效性用三次重复和每治疗Ñ种子的数量执行不低于20和结果的平均值。空压力对工作效率的影响在工作液浓度恒定（OD00 = 1.0~1.5）和真空处理时间（1min）的条件下，真空压力为选择如下：0.02，0.04，0.06，0.08兆帕在侵染后的土壤种子紫微侵染真空播种发芽，接着在光的绿色荧光蛋白的表达幼苗发现和登记后的紫外线。空处理时间对工作效率的影响在压力真空条件下（0.08 MPa）和细菌工作液浓度（OD00 = 1.0~1.5），处理时间真空被选择如下：1，10，15分钟，以侵入沉香树染色，接种，播种在土壤中的种子，植物的发现之后，绿色荧光蛋白的表达在紫外光下跟踪并记录。真空压力（0.08MPa）和真空处理时间（1分钟）的条件下选择工作流体浓度对工作效率的影响。作流体的浓度对于沉香树，OD600 = 0.3，0.6，0.9，1.2，1.5。种子真空感染，接种并接种于土壤中。现植物后，在紫外光下监测绿色荧光蛋白的表达并记录。较了萌发种子的真空感染方法和叶片注射方法，选择相同浓度的细菌溶液，采用叶片注射法和种子感染法。空发芽分别用于接种。可溶性蛋白在所述外源蛋白的表达的峰收集，15％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并转移到膜上，RUBISCO的大亚基被用作参考通过抗GFP抗体检测外源蛋白的表达。验结果鉴定的棕色早期病毒这两种载体均与植物同时接种完成GFP基因的工作normal.Le感染片段上pCAPE2-GFP载体和片段早期棕色病毒紫微紫微的矢量的PCR通过PCR进行pCAPEI特异性的。别，实验结果为阳性，结果在图1中呈现的真空系统感染的发芽发芽的种子，随后通过观察GFP的表达在UV光下（连续观察PCP 15天）。管真空处理的持续时间不同，但表达率和GFP表达的模式基本相同。
空感染周（从沉香树的植物中提取的）后开始绿色荧光蛋白的表达，然后GFP的表达水平增加，并且表达水平达到90％12-14感染后几天。果如图2A所示。验表明，真空压力是在实验体系的有效性的重要因素：取决于感染的时间和工作流体的浓度，几乎没有植物中表达的绿色荧光蛋白在真空压力为0.02MPa，GFP随真空压力增加。达水平增加，GFP的表达水平最高，为0.08MPa，实验结果如图2B所示。菌的工作流体的浓度是影响système.Les的效率的实验结果示出了另一重要因素在于的GFP的表达增加水平与细菌的工作流体浓度当流体的浓度OD600 = 0.9-1.5 90％的红木植物表达绿色荧光蛋白，实验结果如图2C所示。过真空侵染和叶片注射分别进行真空侵染法和发芽种子叶片注射法的比较，观察GFP表达后的表达。种。了第八天，绿色荧光蛋白的表达是发现commencée.Après植物材料真空的侵扰，植物的茎首次表达绿色荧光蛋白，并出现在主脉新叶的侧脉。染后12至14天GFP在叶肉中。量的表达和传播;植物材料，绿色荧光蛋白箔注入法，
沉香树在开始注入的叶表达，然后扩散到邻近于所述主轴与在主流和相邻板的侧缝和新连续显示感染后GFP〜14D在叶肉大量表达，如示于图3的总可溶性蛋白大花沉香树L.在约15D萃取，将外源蛋白在两种方法的表达通过大的Rubicon亚基作为内部参考比较接种。验结果在图4中呈现的大亚基Rubisco酶的杂交的结果表明，每个轨道（5〜7）的植物蛋白的电荷量基本上是相同的和的结果GFP杂交表明两种接种方法中外源蛋白的表达水平是相同的。用植物瞬时表达外源蛋白具有其主要优点：操作简单，实验周期短，外源蛋白高表达。种现有的接种方法具有优点和缺点。这项研究中，使用沉香树（Lagerstroemia）作为实验材料创造了一种新植物。种的一种新方法，细菌D0600的流体工作浓度= 1.0〜1.5，进行1分钟的真空处理0.08兆帕的是该系统的最佳状态，真空压力和细菌浓度是影响实验系统的关键因素，当工作液浓度很低时，几乎没有GFP的表达。GFP表达水平随着工作流体的压力和浓度的增加而增加。真空压力为0.08MPa时，细菌工作流体的浓度为OD 600 = 1.0~1.5，大于90％。
纱植物表达了绿色荧光蛋白。方法是相对于喷射方法片常用：叶注入方法需要在接种前两到三个完全展开的叶片（播种后2〜3周），和接种必须接种一个接一个由片材，和沉香树真空侵染的方法豆芽直接感染沉香树种子为硬件，并且可以在同一时间进行接种批次：外源蛋白通过以下方法获得的周期叶注射约30天，真空接种发芽种子的方法获得外源。
白质的实验期约为15天。感染12至14天后，两种方法中外源蛋白的定量表达最高。白质的定量分析表明外源蛋白质的表达是等同的。用两种不同接种方法的比较。芽种子的真空感染方法被认为是一种在沉香树植物中快速表达外源蛋白的新方法。
本文转载自
沉香树 http://www.cqmiaojunmm.cn
首页
短信