为了研究根瘤菌3841通透的rl1568基因的作用下，rl1568突变型酶基因可渗透纹枯病通过同源重组构建。果表明，该基因rl1568的突变没有影响自养条件下，菌株的生长，突变菌株对低浓度氧化物的高度敏感和她推邪恶。量荧光RT-PCR结果显示H2O2不能诱导rl1568基因的表达。栽试验表明，rl1568基因突变对根瘤菌对氮的共生结合能力没有影响。
键词：豌豆根瘤菌;通透; rl1568基因;抗氧化剂;共生固氮分类号：Q936文献代码：A文章编号：0439-8114（2015）18-4613-04DOI：10.14088 /j.cnki.issn0439-8114.2015.18.057细胞膜充当细胞与细胞外环境之间选择性渗透的屏障，一方面可以吸收必需的营养物质，消除代谢废物并浓缩细胞内离子。一方面，调节细胞维持相对稳定的内部环境，因此物质的跨膜转运对细胞存活和生长极为重要。膜转运过程主要依赖于膜蛋白，有时与位于细胞质中的细胞外受体和调节蛋白功能相关[1-3]。
种蛋白质复合物可称为转运蛋白。透。瘤菌是一种革兰氏阴性细菌的，可以在豆科植物真菌的形式存在：首先，氮固定在由植物氮的所需的源，在另一方面，它是由植物提供的氮源储存。了建立这种共生系统，土壤中存在的根瘤菌必须在根系环境中繁殖，并与其他生物竞争营养。根瘤菌中发现的越来越多的载体对于根瘤菌定殖根是重要的。养素如氨基酸[4]。根瘤菌中，基因permaase氨基酸Aa和胸罩的双突变后，根瘤菌的生长是因为不能使用氨基酸如谷氨酸，谷氨酰胺，脯氨酸和明显天冬氨酸。响[5]。外，在链球菌肺炎发现该酶PSA的渗透性，这是ABC转运，不仅参与了锰离子的传输，而且对全身毒性和保护，防止超重要作用和过氧化物[6]。Rl1568一个通透酶基因（NC_008380.1），编码362个氨基酸（YP_767172.1）的蛋白质，包含属于超家族YjgP / YjgQ六个跨膜区域。家族YjgP / YjgQ存在于许多领域，如一个膜结构[7]单独或与其他领域，如在组氨酸激酶[8]和脂肪酶[9]，所述功能的存在被认为是一种通透酶。[10]，但具体的功能机制尚不清楚。个内膜蛋白YjgP和YjgQ属于超家族YjgP / YjgQ在大肠杆菌中发现的是在LPS脂多糖的运输重要，推测作为ABC转运系统[11]的一部分，而在Rhodopirellula波罗SH在1中，它应该是一种信号肽[12]。
此，基于根瘤菌突变体菌株的构建radicans 3841 rl1568的rl1568基因进行了研究和实验自养symbiotiques.Le rl1568基因受生长和氮结合能力共生，并通过RT-PCR分析相关基因的表达。阐明rl1568基因的调控机制提供依据。料和方法材料质粒和作物纹枯病3841和pK19mob克隆载体是由菲利普·普尔小号教授，英国牛津大学提供。
LB培养基[13]用于大肠杆菌的培养，所述TY培养基[13]和中间AMS [14]水稻纹枯病菌的培养。于根瘤菌培养抗生素：链霉素（STR），新霉素（新），卡那霉素（KM）和四环素（TC），购自Sigma公司，使用海峡的浓度，500微克/毫升; 80μg/ mL; Tc，2μg/ mL;用于生长大肠杆菌的抗生素浓度：Km，20μg/ mL; Tc，5μg/ mL。要试剂和仪器Hind III和XbaI限制酶，T4 DNA连接酶，RNAiso Plus等。（TAKARA）;高保真的Phusion酶，Taq DNA聚合酶（Thermo Scientific）进行，DNA（Bodatek）生物技术有限公司，试剂盒PrimeScriptTM RT用橡皮擦的gDNA（实时最佳），通用的FastStart SYBR的凝胶恢复包绿色硕士（罗氏），UV-Vis分光光度计（上海光谱仪，型号752）PCR仪（Biometra公司），通过荧光PCR仪定量仪（Applied Biosystems）。建r1558基因的插入突变体rl1568基因的突变根据Luo等人的方法进行。[15]。稻纹枯病菌3841的总DNA作为模板和目标片段用引物扩增Pr1568-1F / Pr1568-1R示于表1中。
述引物将扩增产物用空载体消化pK19mob的XbaI和Hind III分别并用T4 DNA连接酶连接过夜，然后引入到DH5α中，并通过PCR和测序确认得到质粒阳性克隆pK1568。含有质粒pK1568大肠杆菌作为供体菌株，3841是一个受体菌株和含有pRK2013的用作辅助菌株用于杂交tripartite.Le缺失突变质粒的大肠杆菌通过测试的电阻和验证引物Pr1568-map / M13F。应力作用下的H 2 O 2和RL1568的3841菌株的生长而不变形活化用AMS洗脱并在50ml培养基中接种，得到0.01的AMS初始OD600纳米，每株3个重复，28将混合物搅拌在搅拌温度为200℃下以200rpm转速，并以600nm DE间隔取样。抑制试验区，在对数生长期的试验菌株用生理盐水和再溶解，然后涂布在琼脂平板AMS.Une干燥板后，将圆形滤纸用不同浓度的浸渍氧化物放置在板的中心。板用圆形滤纸，每种浓度重复3次，用于确定抑制区的直径。化物是过氧化氢（H 2 O 2）和氢过氧化枯烯（CuOOH），其中CuOOH用无水乙醇稀释至不同浓度。基因相关的抗氧化剂的表达对细菌RNA提取[16]的电平通过qRT-PCR的分析中，3841在液体介质中AMS接种，初始OD 600为0.01，与搅拌在28℃下在600纳米和0.3纳米至0.6纳米之间的振荡器200转/分钟，将细胞通过离心收集，并用生理盐水溶液和0.5毫摩尔/ L H2O2为1处理的小时。过Trizol方法提取总RNA，然后使用带有gDNA Eraser试剂盒的PrimScriptTM RT试剂盒进行反转。用相关抗氧化基因的cDNA引物和内部gyrB1参照基因的引物对cDNA模板进行实时PCR（表1）。据Poole等人的方法，在无菌蛭石罐中进行盆栽植物的试验。[17]。旦表面灭菌和发芽，将
沉香树种子播种在灭菌的蛭石塑料烧杯中。豆生长与没有氮气种植当营养液，添加对应于每个沉香树，2沉香树重复3.保鲜膜细菌溶液1毫升加盖并置于用于培养的培养箱3周后，通过乙炔还原法测量结节固氮酶活性。瘤菌（Rhizoctonia glabra）3841 rl1568突变体基因构建体的结果和分析根据Karunakaran等人构建的方法。[18]，利用Pr1568-map / pk19A通过PCR成功扩增重组质粒，成功扩增出约1kb的靶片段。1），获得rl1568基因的突变体RL1568。
述基因的突变是rl1568敏感H2O2.La突变rl1568基因不影响该菌株的正常生长，所述RL1568和3841分别接种AMS介质上时，初始OD 600纳米为0.1和OD600每隔一段时间测量nm。果（图2）表明，生长RL1568突变体不是来自野生型3841显著不同，
沉香树表明rl1568基因对水稻纹枯病菌3841的的生长没有影响显著该基因的rl1568突变影响丝核菌solani.H2O2 CuOOH和过氧化物的抗氧化能力被用作研究3841抑制在不同浓度（表2）的野生型和突变株的RL1568的区域的直径。H 2 O 2和CuOOH的浓度分别为100毫摩尔/ L和50毫摩尔/ L，突变体区的抑制作用的直径为培养24小时后比野生型3841的显著更大，但不同的很重要。大这表明rl1568基因对低浓度的H2O2和CuOOH更敏感。过RT-PCR分析与氧化相关的基因的表达，并用2-ΔΔCt处理。0.5mmol / L H 2 O 2处理的3841中rl1568基因的表达为0.98±0.5，表明r1568。因表达不受H2O2的影响。栽试验4周突变株和野生型RL1568 3841至沉香树，接种后的植物接种RL1568突变菌株能够形成有效根瘤玫瑰和活动nitase植物沉香树通过乙炔还原过程确定。果表明，野生型3841的固氮酶活性为3.58±0.44摩尔/（克·h）和该RL1568的3.39±1.19摩尔/（克·h）时，这并未表明固氮酶活性的显着差异，表明rl1568基因的突变是结节。
氮没有显着影响（图3）。结和讨论OM细胞膜的外部结构作为阻断有毒物质如洗涤剂和抗生素的选择性屏障[19]。根瘤菌和豆科植物共生固氮，由根瘤菌分泌的外膜蛋白在根毛，结节形成和感染性结构的吸附和在保护细胞中起重要作用反对植物防御反应[20]。这个实验中，发现rl1568通透酶基因的突变对纹枯病3841的正常生长没有显著的影响，但它是氧化物，如过氧化氢和CuOOH水平低敏感。氧化物的低浓度下，抑制突变体RL1568的的区的直径比野生型3841的显著更大，但有两者之间没有差异显著当氧化物浓度的增加。H 2 O 2处理后，在野生型菌株的基因rl1568的表达水平为0.98±0.5，这表明该基因rl1568的表达没有受到外部H2O2。外，通过盆栽试验，发现该基因rl1568的突变没有影响氮纹枯病的结合能力。该基因编码的产物属于rl1568通透YjgP / YjgQ，对所述抗氧化剂通透YjgP / YjgQ没有报告，但rl1568基因机构和YjgP / YjgQ通透还有待研究。
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